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大客车凌晨2点到5点不能在高速公路上行驶，夜间在道路上（高速公路、混合道路）行驶的客运车辆凌晨2点至5点必须就近停靠在安全地带，落地休息，驾驶员要及时提醒车上旅客不要随意走动，照看好随身携带的物品，如有需求及时联系驾驶员等。

根据《道路旅客运输企业安全管理规范》第38条规定：长途客运车辆凌晨2时至5时停止运行或实行接驳运输。

客运企业不得要求客运驾驶员违反驾驶时间和休息时间等规定驾驶客运车辆。企业应主动查处客运驾驶员违反驾驶时间和休息时间等规定的行为，发现客运驾驶员违反驾驶时间和休息时间等规定驾驶客运车辆时，应及时采取措施纠正。