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大客车不能在高速公路上行驶的时间是凌晨两点至五点。

根据《道路旅客运输企业安全管理规范》四十五条规定，夜间上路行驶的客运车辆必须在凌晨2点至5点之间停在附近的安全区域。同时，司机应及时提醒车上乘客不要随意走动。

根据道路旅客运输企业安全管理规范第三十八条：客运企业在制定运输计划时应当严格遵守客运驾驶员驾驶时间和休息时间等规定：

1。日间连续驾驶时间不得超过4小时，夜间连续驾驶时间不得超过2小时，每次停车休息时间应不少于20分钟；

2。在24小时内累计驾驶时间不得超过8小时；

3。任意连续7日内累计驾驶时间不得超过44小时，期间有效落地休息；

4。禁止在夜间驾驶客运车辆通行达不到安全通行条件的三级及以下山区公路；

5。长途客运车辆凌晨2时至5时停止运行或实行接驳运输；从事线路固定的机场、高铁快线以及短途驳载且单程运营里程在100公里以内的客运车辆，在确保安全的前提下，不受凌晨2时至5时通行限制。